Karier Di Biagio sebagai pesepak bola terhitung lumayan mengesankan. Berbagai macam klub teratas Italia pernah diperkuat pria kelahiran Roma, 3 Juli 1971 ini. Dia pernah bermain di Lazio, Roma dan Internazionale. Perjalanan Di Biagio cukup unik, dirinya bertumbuh bersama Lazio.

Dia merupakan didikan klub berjuluk Biancoceleste itu. Namun, di sana ia tidak mendapatkan tempat layak dan hanya sekali bermain bagi Lazio pada musim 1989-90. Dia kemudian hidup nomaden dari Foggia, Monza dan mulai dikenal sebagai gelandang bertahan jempolan justru di klub AS Roma, musuh bebuyutan Lazio. Di Biagio gabung I Giallorossi sejak musim 1995-96.

Di Biagio bermain selama empat musim di Roma dengan melahap 114 penampilan. Kariernya kemudian berlanjut di Internazionale selama empat musim pula (1999-2000 hingga 2002-03). Selepas dari Inter, Di Biagio menjalani masa tua di Bresica dan Ascoli, sebelum gantung sepatu pada tahun 2007.